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本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终合成miRNA对应的第一链cDNA。

本试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修饰过程及修饰后逆转录过程需要的全部试剂。该试剂盒具有非常高的Poly(A)修饰和逆转录效率，可以从1ng～2μg的total RNA中有效获得miRNA对应的cDNA第一链。并且操作简便、快捷，可以用于从一个反应合成的cDNA中同时检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。

• 本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒(染料法)(货号：WE0158)配套使用。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
    
  • 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
  • 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

• miRNA加Poly(A)尾的过程：
  
  • 首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1mM Tris(pH8.0)来稀释10mM ATP：
    ATP稀释系数=5000/__ng的总RNA
    例：如果总RNA的起始用量为100ng，那么ATP稀释系数=5000/100=50。即将ATP稀释50倍(1μL的10mM ATP加49μL的1mM Tris,pH8.0)。
    
  • 向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25μL。
    

    成分	用量	终浓度
    total RNA	X μL	可达2μg
    10×Poly(A)Polymerase Buffer	2.5μL	1×
    第“1”步中稀释好的ATP	1μL	—
    E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μL)	0.5μL	2.5U
    RNase-Free Water	至25μL	—

    
    注意：反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以直接使用小分子RNA(建议加入量为2～5μL。请根据目的miRNA的丰度来确定加入量)。
    
  • 轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。37℃，孵育15分钟。此过程结束后，立刻进行第一链cDNA的合成，或于-20℃暂存。如需长期保存，建议存放于-80℃。
• 修饰后的miRNA cDNA第一链合成的过程：
  
  • 向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20μL：
    

    成分	用量
    上述Poly(A)反应液	4μL
    UltraPure dNTP Mix(10mM each)	1μL
    RT Primer(25μM)	3μL
    5×UltraRT Buffer	4μL
    UltraRT	0.5μL
    RNase-Free Water	7.5μL

  • 轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。42℃，孵育50分钟。
    
  • 85℃，孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。